Problémy s produkcí antimikrobiálních peptidů v bakteriích překonány!

Antimikrobiální peptidy jsou nízkomolekulární proteiny dlouhé 12-50 aminokyselin. Jedná se o prastarou a evolučně nesmírně konzervovanou imunitní složku řady organismů, od rostlin až po člověka. Disponují širokou paletou účinku proti bakteriím, houbám a virům. Obvykle nesou kladný náboj a amfifilní charakter, kdy se jedna část molekuly chová hydrofobně a druhá hydrofilně, proto jsou rozpustné jak ve vodě, tak i v lipidických membránách.

Jakmile se dostanou do cílové mikrobiální buňky, usmrtí ji. Mechanismy jejich účinku se liší od vytvoření póru v membráně, přes interferenci s metabolismem mikroba, až po různé cíle v jeho cytoplazmě. Skýtají proto široký terapeutický potenciál od nové generace antibiotik, přes hojení ran, předcházení a odstraňování infekcí z těla, až po cílené snižování imunity např. při transplantacích orgánů nebo autoimunitních onemocněních (Izadpanah a Gallo, 2005 a wikipedia).

Vzhledem širokému potenciálnímu využití těchto látek a poměrně omezené znalosti, kterou o nich máme, bylo zapotřebí vyvinout efektivní systém pro jejich produkci ve velkém měřítku. V dnešní době je stále ještě nejpoužívanějším nástrojem na produkci proteinů bakterie Escherichia coli. Hlavním důvodem její obliby zůstává rychlost růstu a výborná bilance cena-výkon. Z logiky věci je čtenáři hned jasné, že produkovat antibakteriální peptidy v bakterii je opravdová výzva. A čínští vědci se do jejího překonání pustili.

Do N koncové fúze s antimikrobiálním peptidem použili mutantní proteázu viru prasečí horečky, která umí sama sebe vyštěpit z fúzního proteinu a kromě toho je extrémně hydrofobní. Produkce takového proteinu samozřejmě v bakteriích vede ke tvorbě inkluzních tělísek a to jim doslova zachraňuje život. Protože jsou geny pro antimikrobiální peptidy velmi krátké, je velmi obtížné poznat, která bakterie cílový konstrukt nese a která ne. Vědci elegantně vyřešili i tento problém použitím zeleného fluorescenčního proteinu, jehož gen se v průběhu klonování naruší vložením genu pro antimikrobiální peptid. Po klonování tedy snadno poznáte bakterie, u kterých bylo klonování úspěšně, protože budou od UV lampou bílé, zatímco ty, které cílový gen nenesou, budou svítit zeleně.

Klonování nese ještě jednu podstatnou výhodu a to sice, že bylo provedeno bez použití restrikčních míst. Při běžném klonování za pomocí restrikčních míst totiž často dochází k přidání jedné nebo více aminokyselin k proteinu našeho zájmu, což by při analýze tak krátkých peptidů mohlo značně ovlivnit jejich vlastnosti (Ke a kol. 2012). Místo toho vědci použili rekombinantní strategii, během které se gen nasyntetizovaný pomocí PCR sám vloží do vektoru v E. coli pomocí homologní rekombinace (Muyers a kol. 2001).

Expresní systém byl úspěšně testován pro šest antimikrobiálních peptidů různých velikostí, například lidský histatin 6 a 9, temporin G, hexapeptid a další. Úroveň exprese dosáhla krásných 40% celkového buněčného proteinu. Po rozpuštění inkluzních tělísek získaly antimikrobiální peptidy znovu svou správnou konformaci a po zakoncentrování pomocí afinitní chromatografie se z nich proteáza sama vyštěpila a zanechala intaktní antimikrobiální peptid se správným počtem aminokyselin, který prokázal aktivitu vůči laboratorním bakteriálním kmenům: Escherichia coli ATCC2592, Micrococcus luteus a Saccharomyces cerevisiae (Ke a kol. 2012).

Vědcům se tedy podařilo představit jednoduchou, levnou a velmi robustní metodu produkce plně funkčních antimikrobiálních peptidů a otevřeli tak cestu k jejich vysokoprůchodnému testování, které se jistě stane odrazovým můstkem pro aplikovaný výzkum těchto látek.

Autor: RNDr. Klára Kazdová

Líbil se Vám tento článek? Doporučte jej svým známým.

Použité zdroje:

Originální studie:

Ke T., Liang S., Huang J., Mao H., Chen J., Dong C., Huang J., Liu S., Kang J., Liu D., Ma X.(2012): A novel PCR-based method for high throughput prokaryotic expression of antimicrobial peptide genes. BMC Biotechnol. 12:10. doi:10.1186/1472-6750-12-10

Další použité zdroje:

Muyrers J.P., Zhang Y., Stewart A.F. (2001): Techniques: Recombinogenic engineering--new options for cloning and manipulating DNA. Trends Biochem Sci. 26(5):325-31.

Izadpanah A., Gallo R.L.(2005): Antimicrobial peptides. J. Am. Acad. Dermatol. 52:381-90.

Wikipedia