Hlavní strana Autorské články a zajímavosti ze světa biotechnologií MinION – mobilní čtečka DNA do kapsy

MinION – mobilní čtečka DNA do kapsy

Datum: 5.9.2016

Byl slunečný den roku 1989. Biofyzik David Deamer zastavil svůj automobil na silnici California’s Interstate 5, protože mu v hlavě probleskla geniální myšlenka. Představil si molekulu DNA, jak prochází mikroskopickým pórem v tenké membráně. Rychle vytáhl tužku a papír a průlomový nápad, jak přečíst písmena genetického kódu molekuly DNA, byl na světě.

Po 27 letech od prvotní myšlenky Davida Deamera již existuje komerčně dostupný sekvenátor, který má ambice změnit klasické sekvenování na sekvenování nové generace.

Poslední verze přístroje, nazvaného MinION, se od konce roku 2014 testuje ve vybraných genetických laboratořích po celém světě. K funkčnímu přístroji však vedla strastiplná cesta vývoje a testování. Mnozí experti a vědci nedávali zpočátku přístroji moc velkou šanci na úspěch. V roce 2012 byl poprvé představen první prototyp a technologie „Nanopore Sequencing“ se již tehdy dostala mezi tzv. „Top 10 nejprůlomovějších technologií“. Sekvenátor vyrábí britská firma Oxford Nanopore, která vynaložila 292 milionů dolarů a posledních 10 let strávila intenzivním vývojem, aby vdechla život geniální myšlence Davida Deamera, a vytvořila tak unikátní sekvenátor.

Sekvenátor již nyní drží rekord v několika kategoriích. Podíváme-li se na jeho rozměry, nemá sekvenátor MinION konkurenci. Na délku měří 6cm a energii si bere z USB portu stolního počítače nebo notebooku. Oproti konkurenčním sekvenátorům, které rozměrově odpovídají větší lednici a vyžadují drahé chemikálie a přípravy před vlastním čtením DNA, MinION čte sekvenci DNA přímo tak, jak prochází skrze nanopór (nano = 10^-9 m) v tenké nanomembráně. Tím, jak se molekula „prosoukává“ skrze nanopór, dochází ke změně elektrického proudu mezi elektrodami umístěnými v elektrolytu na obou stranách membrány. Průchod různých nukleových bází (A, C, T, G) neboli písmen genetického kódu pak vyvolá různou změnu proudu a výsledný záznam se následně vyhodnocuje ve speciálním programu přímo v připojeném PC. Čtení DNA probíhá tedy téměř v reálném čase.

Po první zkušenosti s prototypem MinION vědci tvrdí, že má přístroj ještě několik problémů a čtení sekvence DNA není přesné. Na druhou stranu však dodávají, že je to určitě cesta, jak studovat DNA v budoucnosti. Mick Watson, bioinformatik z Roslin Institute, po několika testech říká, že nanopórové sekvenování je skvělá a vzrušující technologie, která by potenciálně mohla v nadcházejících letech dominovat v oblasti rychlého čtení genetického kódu.

Jednou z podstatných nevýhod byla donedávna velká nepřesnost při čtení sekvence DNA. Pokud by se podařilo zpřesnit čtení u MinION, mohl by nabídnout využití, o kterém se zatím píše jen v románech sci-fi. Se svou malou velikostí by MinION umožňoval studovat DNA přímo v terénu po odebrání vzorků vody nebo potravin a hledat např. škodlivé patogeny, ze vzorku DNA identifikovat osoby podezřelé ze spáchání trestného činu nebo ihned po odebrání pacientovy krve identifikovat viry způsobující smrtelné epidemie. V posledním případě byl již MinION využit při identifikaci mutací viru Ebola (více zde a zde).

MinION je výsledkem riskantní sázky R&D Oxfordské firmy čítající 200 zaměstnanců, která si položila za cíl vytvořit vysokorychlostní real-time sekvenátor. Prorazit na trh však nebude snadné. Přibližně 90% veškerých čtení DNA na světě totiž provádí přístroje jediné firmy a tou je Illumina se sídlem v San Diegu. Jejich sekvenátory jsou tak dobré, že většina konkurentů končí nebo oznamuje konec provozu vlastních sekvenátorů.

Mohla by tedy firma Oxford Nanopore zlomit monopol firmy Illumina? Podle posledních kroků konkurenčních firem se zdá, že by technologie nanopore sekvenování mohla být cestou budoucího realtime čtení genetického kódu. Asi zatím největší konkurent, firma Roche, která se v roce 2012 neúspěšně pokusila koupit právě firmu Illumina, totiž nyní utratila více než 125 milionů dolarů na nákup malé firmy Genia Technologies v Kalifornii, která se též zabývá nanopore technologií. Dalšími hráči na trhu, kteří oznámili vývoj vlastního sekvenátoru s nanopore technologií, jsou firmy Hitachi a Electronic Biosciences. Boj o svržení monopolu firmy Illumina tedy teprve začíná.

Nápad Davida Deamera na nanopore sekvenování přišel pouze tři roky poté, co bylo představeno automatizované čtení DNA pomocí klasické Sangerovy metody. Zprvu se Deamer snažil napodobit živé buňky a to, jak skrze póry v membráně transportují molekuly DNA. Vytvořil mikroskopické tukové kuličky a skrze póry v nich obsažené se snažil „pumpovat“ DNA dovnitř a ven. Tím, jak skrze pór procházelo jiné písmeno DNA, měnil se i specificky signál, v tomto případě elektrický proud, který bylo možno měřit. Ovšem zabralo to dalších 25 let vývoje, než byl vytvořen první funkční prototyp, sekvenátor MinION. Bylo třeba překonat nemalé technické problémy. Pro představu, každé písmenko (A, C, T, G) v molekule DNA je pouze půl nanometru vzdálené od toho předchozího a některá písmenka se liší jen v jednom nebo dvou atomech.

Jak je tedy možné protáhnout molekulu DNA pórem v membráně tenké pouze jednu stotisícinu lidského vlasu a číst sekvenci rychlostí 250 „písmen“ za sekundu, tak jak to umí současná verze MinION Mk 1B?

"Mnoho zkušených vědců tvrdilo, že nanopórové sekvenování není technicky možné,“ říká Jeffery Schloss, vedoucí divize genomických věd v National Human Research Institute v Bethesdě v Marylandu. „Ovšemže je to možné. Otázka však nyní je, zda je to dost dobré pro využití v praxi.“

Firma Oxford Nanopore totiž již jednou své příznivce zklamala. Bylo to právě v roce 2012, kdy ohlásila poprvé funkční prototyp. Pak se ale na dlouhou dobu odmlčela a mnozí si mysleli, že je to další příklad tzv. vaporware (tj. produkt, u kterého firma oficiálně ohlásí výrobu, ale nikdy k ní nakonec nedojde).

Ovšem na jaře 2014 Oxford Nanopore překvapivě oznamuje, že „vychytali mouchy“ a firma začala rozesílat prvních 500 MinIONů do testovacích laboratoří, se kterými spolupracuje. Do poloviny roku 2014 pak firma vydala 2 updaty, což ukazuje, jak rychle se snaží sekvenátor zdokonalit a dotáhnout do konkurenceschopné verze.

David Deamer a Mark Akeson patří mezi vyvolené vědce, kteří MinION od konce roku 2014 testují. „Je neskutečné, když vám 100g sekvenátor přijde v balíčku FedEx“, říká Mark Akeson. Deamer i Akeson mají velmi úzké vazby na Oxford Nanopore a sami dodávají, že MinION je pouze začátek. Stále je třeba zlepšovat přesnost čtení.

První testy MinION totiž uváděly, že přístroj čte správně pouze 60 – 85 % testované DNA. To rozhodně nebyla pozitivní zpráva v porovnání se sekvenátory firmy Illumina, které mají přesnost 99,9%. Jejich přesnost je ovšem patřičně oceněna a za takový přístroj zaplatíte 1 milion dolarů. U aktuální verze MinION Mk 1B z července 2016 už firma uvádí přesnost čtení 95-99%, což už by mohlo zvednout pár lidí z firmy Illumina ze židlí. Nanopore technologie je tak odlišná od „klasických“ nextgen sekvenátorů, že i přes větší chybovost čtení může být nejen pro vědu, ale i praktické využití, velkým přínosem.

Jedním z důvodů je fakt, že současné sekvenátory včetně těch od Illuminy neumějí číst dlouhé fragmenty DNA nad 300 bází (písmen). Pokud z těchto krátkých fragmentů chcete např. poskládat kompletní genom bakterie čítající miliony bází, je to poměrně složitý problém. Obzvláště problematické je např. správné poskládání repetitivních úseků v genomu.

V této oblasti by mohl výrazně pomoci právě MinION a jeho nanopórové sekvenování, protože dokáže číst o mnoho delší fragmenty DNA. U testované lidské DNA dokázal MinION číst fragmenty o délce 79 000 bází, což je současný rekord v délce čtení. Z takto dlouhých sekvencí se pak mnohem snáze poskládá genom živočicha, rostliny nebo bakterie.

Další nespornou výhodou je cena jednoho sekvenátoru MinION. Ta se u současné verze pohybuje kolem 1 000 dolarů. Dalším příslušenstvím jsou vlastní články obsahující matrici s nanopóry (těch je na matrici cca 2 000) a jejich cena se pohybuje mezi 500 a 900 dolary, podle počtu zakoupených kusů. Články s membránou se po proběhnutém čtení, které trvá maximálně dva dny, promyjí speciálním roztokem a jsou znovu připraveny pro opětovné použití. Samozřejmě při opakovaném použití klesá účinnost a množství přečtených fragmentů DNA. I tak je ale cena za analýzu jednoho vzorku v porovnání se sekvenátory firmy Illumina mnohonásobně nižší.

V současné době Oxford Nanopore oznámil novou verzi PromethION, který bude mít 100 000 pórů na matrici a bude tak schopný konkurovat Hiend sekvenátorům firmy Illumina.

DNA sekvenátor velikosti USB flashdisku by tedy v budoucnu mohl změnit podstatu výzkumu genů.

Autor: Ing. Jiří Bárta, Ph.D.

Líbil se Vám tento článek? Doporučte jej svým známým.