Osekvenování DNA nekultivovatelných mikroorganismů

Chceme-li nahlédnout do genomu bakterií, potřebujeme dostatečné množství DNA k analýze. Kultivační metody nám umožňují pomnožení bakterií na nebo v uměle připravených živných půdách za účelem zisku kolonií čistých bakteriálních kultur a dostatečného množství genetické informace. Převážná většina bakterií se ovšem řadí mezi nekultivovatelné mikroorganismy. Tyto bakterie na kultivačních médiích zkrátka nerostou, a tudíž je obtížné se k jejich genetické podstatě dostat. Nová technika sekvenování pouze jediné buňky umožňuje celý proces kultivace přeskočit.

Když nedokážeme kultivovat

„Většina známých, již osekvenovaných genomů pochází od mikroorganismů, které jsme schopni laboratorně kultivovat." Říká ředitel Department of Energy Joint Genome Institute Eddy Rubin a pokračuje:„Odhadujeme, že zhruba 99,9 procent mikroorganismů, které se na Zemi vyskytují, nedokážeme běžnými metodami kultivovat." Chceme-li se však dozvědět o nekultivovatelném mikrobovi více, musíme zvolit alternativní přístup - sekvenaci genomu pouze jediné buňky.
Princip metody tkví v oddělení požadované buňky ze složitého vzorku odebraného v životním prostředí, uvolnění její DNA, namnožení pomocí enzymů tak, abychom měli dostatek genetické informace k sekvenování a rozluštění jejího genomu.

Výše popsaným způsobem se podařilo osekvenovat i nekultivovatelné mikroorganismy vědcům z amerického Department of Energy (DOE) Joint Genome Institute (JGI) a z Bigelow Laboratory for Ocean Sciences. Svoji práci publikovali letos v dubnu ve 23. vydání časopisu PLoS One.

Vědkyně Tanja Woyke

Biotechnologický potenciál flavobakterií a proteorodopsiny

Vědkyně Tanja Woyke společně s jejími kolegy sekvenovali genomy dvou nekultivovatelných mořských flavobakterií, u nichž je známá schopnost degradace biopolymerů. Bakterie separovali z  povrchové mořské vody odebrané v Maine Boothbay Harbor.
Flavobakterie nezvolili náhodou. Vybrali si je, protože obsahují geny kódující proteorodopsiny. Proteorodopsiny jsou bílkoviny ukotvené v buněčné membráně, které pracují jako protonové pumpy. Vychytávají sluneční světlo a dokážou přeměnit energii světelnou na energii chemickou. „Proteorodopsiny umožňují některým mikroorganismům využívat sluneční energii, ovšem odlišným mechanismem než je tomu u fotosyntézy," řekl Ramunas Stepanauskas z Bigelow Laboatory.
„Naším cílem je identifikovat a sekvenovat specifickou skupinu mikroorganismů, které nesou proteorodopsinové geny, analyzovat jejich genom a posvítit si zejména na potenciál proteorodopsinu v biotechnologii," vysvětluje Stepanauskas.

Od mořské vody k DNA

K oddělení buněk přímo ze vzorků přírodního prostředí použili vědci z Bigelow nákladnou, ale velmi užitečnou metodu, a to fluorescencí aktivované buněčné třídění (fluorescence-acivated cell sorting, FACS). Buňky při něm byly značené fluorescenčně značenými protilátkami proti vybraným antigenům. Pak procházely tenkou kapilárou a byly ozařovány laserem. Měřili zaprvé, jaká část světla se pohltila a rozptýlila, což umožnilo určit velikost buňky, a za druhé fluorescenci. Na základě vhodně zvolených kritérií se pak buňky v proudu tekutiny elektrostaticky odchylovaly a následně rozdělovaly.

Oddělené buňky pak byly lyzovány (narušena buněčná stěna), po uvolnění vnitřního obsahu byl celý genom namnožen medotou Multiple Displacement Amplification (MDA), čímž vytvořili milion kopií genomů k osekvenování.

Vzniklé flavobakteriální genomové sekvence byly přibližně z 80 - 90 procent kompletní. Woykeová výsledek ohodnotí jako uspokojivý.

I když jsou sekvenované bakterie mořské organismy, Stepanauskas upozorňuje, že přístup za použití jediné buňky může být uplatněn na organismech z různých prostředí, ať už půjde o půdu, vodu ze vřídel či mikroorganismy osidlující lidský trávicí trakt.

„Klíčový krok, který je potřeba ještě vypilovat, je lyze buňky. Roztok, který používáme, nebude účinný na všechny mikroorganismy. V současnosti aktivně pracujeme na řešení této otázky," uzavírá Stepanauskas.

Vzorek pobřežní vody z Boothbay Harbor

Poprvé světlo světa spatřila metoda sekvenace DNA z jediné buňky v roce 2005. Tato metoda nabízí nové možnosti na poli výzkumu v oblasti biotechnologie nekultivovatelných mikroorganismů.

Další aplikace

Woykeová nezahálí a po úspěchu zaznamenaném s flavobakteriemi začala s vědci z DOE JGI pracovat na uplatnění „jednobuněčného přístupu" při zkoumání mikrobní komunity osidlující zažívací trakt hovězího dobytka. Chtějí identifikovat enzymy rozkládající celulózu, jejichž využití plánují při produkci biopaliv nové generace.

Autor: Vlasta Stancová

HYPERLINK "http://www.jgi.doe.gov/News/news_09_04_21.html" http://www.jgi.doe.gov/News/news_09_04_21.html.
HYPERLINK "http://en.wikipedia.org/wiki/Proteorhodopsin"http://en.wikipedia.org/wiki/Proteorhodopsin
HYPERLINK "http://bioprojekty.lf1.cuni.cz/3381/sylaby-prednasek/textova-verze-prednasek/bunecne-kultury-vejrazka.pdf" http://bioprojekty.lf1.cuni.cz/3381/sylaby-prednasek/textova-verze-prednasek/bunecne-kultury-vejrazka.pdf