Nová metoda stanovení polohy sacharidových řetězců na glykoproteinech

Již dříve byli vědci schopni analyzovat glykoproteiny, tedy stanovit sacharidový řetězec, který je enzymově připojen na protein, ale nebyli schopni přesně stanovit jeho polohu. Ale i to je nyní možné díky nové metodě vyvinuté ve Švédsku na University of Gothenburg Sahlgrenska Academy. Tamní vědci vyvinuli novou metodu přípravy vzorku ve spojení s hmotnostní spektrometrií. Tato technika, představena v posledním vydání renomovaného časopisu Nature Method, mimo jiné umožní vědcům z oboru medicíny detailněji studovat mechanismy onemocnění a možná i najít nové způsoby jejich léčby.

Obrázek: schematické znázornění glykoproteinu, N-vázaného na asparagin (Asn)

„Analyzovali jsme mozkomíšní mok zdravých jedinců a zjistili jsme, že mnoho proteinů mělo navázané dříve neznámé cukerné struktury", říká Jonas Nillson z Oddělení klinické chemie a transfusní medicíny na Sahlgrenska Academy. „Víme, že některé z těchto proteinů hrají roli při onemocněních, např. při Alzheimerově chorobě, a nyní je možné studovat, zda jsou chyby v těchto cukerných strukturách zodpovědné za vývoj onemocnění".

Studie proteinů, obzvlášť jejich struktury a funkce, se nazývá proteomika. V lidském těle existuje více než 20 tisíc proteinů, které zajišťují vykonání instrukcí zapsaných v genetické informaci. Proteiny se mění v organismu v průběhu života nebo v závislosti na podmínkách, kterým je buňka nebo celý organismus vystaven. Každý protein může podléhat velkému množství post-translačních modifikací. Proto je proteomická studie poměrně komplikovaná.

Asi polovina z proteinů v lidském těle podléhá glykosylaci, což je reakce, při které jsou na proteiny připojeny sacharidy. Je to enzymově řízený specifický proces, na rozdíl od neenzymatické chemické reakce zvané glykace. Při glykosylaci vznikají glykoproteiny, které plní různé funkce. Cukerné struktury neboli glykany na jejich povrchu zvyšují stabilitu proteinu a napomáhají sbalení proteinu, díky čemuž může v některých případech protein pomaleji denaturovat. Také zajišťují, že protein může být rozpoznán jinými proteiny. Některé z glykanů mohou napomáhat vazbě proteinů na buňky nebo jiné proteiny, čehož využívají hlavně buňky imunitního systému. Sacharidové řetězce na povrchu buněk také mimo jiné určují, ke které krevní skupině patříme.

Existují dvě hlavní skupiny glykanů: N-vázané glykany, připojené na dusík asparaginového nebo argininového postranního řetězce a O-vázané glykany, připojené na kyslík hydroxylové skupiny serinu, treoninu, tyrozinu, hydroxylyzinu nebo hydroxyprolinu, nebo na kyslík lipidu, např. ceramidu. Dále jsou produkovány C-vázané glykany nebo fosfoglykany.

V proteomice se pro rychlé stanovení proteinů nejčastěji používá technika hmotnostní spektrometrie s ionizací laserem za přítomnosti matrice (matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry, MALDI MS). Hmotnostní spektrometrie je analytická metoda, která může být použita na určení hmoty pozitivních nebo negativních iontů. Metoda může být také použita k identifikaci velkých molekul jako proteinů a měřit, kolik jednotlivých proteinů vzorek obsahuje.
„Cukerné struktury často hrají důležitou roli v tom, jak buňka nebo protein fungují a jak ovlivňují systémy v těle", říká Nilsson. „Schopnost studovat je detailněji je významný krok vpřed pro biomedicínský výzkum".

Sacharidové řetězce jsou v těchto strukturách připojeny k proteinům jen jedním koncem. Nová technika vyžaduje připojení plastové kuličky na volný konec těchto řetězců a rozdělit glykoproteiny od neglykosylovaných proteinů. Glykoproteiny byly poté podrobeny enzymatickému rozkladu trypsinem na peptidy a z řetězce byla uvolněna plastová kulička. Tak vznikly peptidy s navázanými řetězci sacharidů. Vědci poté analyzovali tyto glykopeptidy i polohu sacharidů pomocí hmotnostní spektrometrie. Analýza fragmentů dovolila identifikaci struktur glykanů a další fragmentace deglykosylovaných iontů vedla k informaci o sekvenci peptidů, díky které bylo možné identifikovat místo připojení glykanů. Z lidského mozkomíšního moku bylo identifikováno 36 N-vázaných a 44 O-vázaných glykoproteinů.

Autor: Dagmar Smětalová

Zdroje:
http://www.sciencedaily.com/releases/2009/10/091019122840.htm
http://www.nature.com/nmeth/journal/v6/n11/abs/nmeth.1392.html
http://en.wikipedia.org/wiki/Glycosylation
http://en.wikipedia.org/wiki/Proteomics