Studium struktury proteinů v živých v buňkách

Přestože došlo k velkému pokroku v metodách exprese, izolace proteinů a určování jejich struktury, optimalizace podmínek se v některých konkrétních případech zdá téměř nemožná. Místo snahy navodit co nejpřirozenější prostředí in vitro pro následné strukturní analýzy ve vodných roztocích nebo krystalech umožňuje in-cell NMR studium struktury proteinů přímo v živých buňkách. Tím nám umožňuje obejít proces purifikace proteinů. Experiment s živým materiálem je založen na stejném principu jako NMR, ale vyžaduje dodatečné metody.

V živých buňkách dochází k vzájemné interakci proteinů a interakcím s jinými nízkomolekulárními nebo vysokomolekulárními látkami. Purifikací se však často zbavíme i kofaktorů a substrátů cílových proteinů, které převádíme do co nejjednoduššího, přesně definovatelného roztoku. Tyto a jiné s proteinem interagující molekuly mohou mít vliv jeho strukturu i stabilitu. In vivo pozorování je oproti klasickým metodám neinvazivní a mohlo by pomoci při odhalování strukturních změn proteinů v důsledku působení určitého podnětu na buňku nebo působení signálu uvnitř buňky.

Nevýhodou této metody je malá senzitivita měření a malá životnost vzorků. Ve studii Daisuke Sakakibary et al. bylo využito in-cell NMR pro určení struktury metaloproteinu (TTHA1718) gramnegativní bakterie Thermus thermopilus. Ten byl s použitím metod genového inženýrství exprimován v Escherichia coli. Naměřená spektra byla podobná těm, která byla naměřena v in vitro podmínkách a vedla k určení stejné struktury jako in vitro data.

In-cell NMR byla s dobrými výsledky aplikována na získání NMR spekter z oocytů Xenopus laevis i z lidských buněk. Stejná metoda byla s úspěchem vyzkoušena i pro větší proteiny jako je krysí kalmodulin (17kDa). Problémem ovšem zůstává nutnost vysoké koncentrace proteinu uvnitř buňky.

Autor: Martin Jacko

Zdroje:

Daisuke Sakakibara et al., Nature, Vol 458/5 March 2009, Protein structure determination in living cells by in-cell NMR spectroscopy, www.nature.com

Tomomi Sakai et al., Journal of Biomolecular NMR, Vol 36/Number 3/November 2006, In-cell NMR spectroscopy of proteins inside Xenopus laevis oocytes