QFPCR – nová metoda prenatální diagnostiky

V rámci prenatální diagnostiky dochází často na cytogenetické vyšetření chromozomální výbavy - karyotypu plodu. Takovéto vyšetření je však zdlouhavé a výsledky v určitých případech nejsou dostupné během dnů, ale spíš během týdnů. Přitom každý den čekání znamená často pro budoucí matku zbytečný stres. Metoda QFPCR umožňuje získat určité informace o karyotypu plodu extrémně rychle - vesměs do druhého dne. Dokáže ale tato nová metoda klasické vyšetření plodu zcela nahradit?

Chromozomální aberace

Normální lidský karyotyp (soubor všech chromozomů v buňce) se skládá ze 46 (23 párů) chromozomů; 22 párů tvoří nepohlavní chromozomy - autozomy (označené číslem od 1do 22) a poslední pár tvoří pohlavní chromozomy - gonozomy (označené X a Y; ženské pohlaví se vyznačuje kombinací XX, mužské pak kombinací XY). Chromozomální aberace jsou vrozené nebo získané odchylky karyotypu. Tyto odchylky se mohou týkat, jak struktury jednotlivých chromozomů (potom hovoříme o strukturních chromozomálních aberacích), tak i počtu chromozomů v buňce (potom hovoříme o numerických chromozomálních aberacích). Klinický význam chromozomálních aberací je různý, některé jsou víceméně bezvýznamné a svého nositele nikterak neomezují, naopak některé jsou naprosto neslučitelné se životem.

Nejznámější a zároveň nejčastější chromozomální aberací je Downův syndrom (v roce 2006 se v ČR narodilo 37 dětí s Downovým syndromem). Tento syndrom je obecně způsoben trizomií chromozomu 21 - jde tedy o numerickou chromozomální aberaci, kdy je v buňkách postiženého jedince přítomen jeden chromozom č. 21 navíc. Mezi další relativně časté a významné chromozomální aberace patří další dvě trizomie autozomů: Edwardsův syndrom (způsobený trizomií chromozomu č. 18; celkem 9 případů u narozených dětí v roce 2006) a Patauův syndrom (způsobený trizomií chromozomu č. 13; celkem 4 případy u narozených dětí v roce 2006). Mezi chromozomálními aberacemi gonozomů jsou významné zejména Turnerův syndrom (způsobený obecně přítomností pouze jednoho pohlavního chromozomu X - karyotypem 45,X) a Klinefelterův syndrom (obecně způsobený přítomností více jak jednoho chromozomu X u muže, nejčastěji karyotypem 47,XXY).

Prenatální diagnostika

Každá z těchto diagnóz významně ovlivňuje život svého nositele, v případě Edwardsova či Patauova syndromu mají postižení jedinci významně zkrácenou délku přežití a většina jich nepřežije první rok života. Prenatální diagnostika vrozených vývojových vad je tak do jisté míry specificky zaměřena právě na detekci chromozomálních aberací, zejména na detekci Downova syndromu. V souladu s platnou legislativou je v ČR možné uměle ukončit těhotenství, pokud je u plodu prokázána závažná vrozená vada nebo chromozomální aberace a to až do dokončeného 24. týdne těhotenství. Úkolem screeningových vyšetření, která jsou v rámci ČR nabízeny všem těhotným ženám, je identifikovat ta těhotenství, u kterých je zvýšené riziko chromozomální aberace. Na takovéto zvýšené riziko může upozornit:

Výsledek biochemického screeningového vyšetření - rozbor určitých, s těhotenstvím asociovaných biochemických látek (markerů) z krve matky.

Výsledek ultrazvukového vyšetření, případně doplněného o hodnocení specifických ultrazvukových markerů sloužících k detekci vybraných chromozomálních aberací (šíjové projasnění - NT [nuchal translucency], přítomnost nosní kůstky - NB [nasal bone], délka stehenní kosti - FL [femur length]. Výsledky se nyní často hodnotí spolu s výsledky biochemického screeningu - jako tzv. kombinovaný screening prvního trimestru.

Vyšší věk matky. Riziko chromozomálních aberací najdeme u všech těhotných matek, ovšem se zvyšujícím se věkem se zvyšuje i toto riziko. Všechny těhotné ženy starší 35let (což je hranice pro tento účel uměle vytvořená) mají právo (nikoliv povinnost) absolvovat invazivní prenatálně diagnostické vyšetření (například amniocentézu - viz dále) pouze z důvodu věku i v případě negativního screeningu.

Těhotným se zvýšeným rizikem je nabídnuta konzultace v ambulanci lékařské genetiky a následně i invazivní prenatálně genetické vyšetření. Účelem invazivní diagnostiky je získat vzorek buněk plodu k potvrzení či vyloučení chromozomální aberace (případně jiných chorob). Existují tři základní metody, jejich použití se řídí především časovým hlediskem:

Odběr choriových klků (CVS - chorion villi sampling) - jde o odběr vzorku z choriových klků - vyvíjející se části placenty. Provádí se zhruba od 10. do 14. týdne těhotenství.
Amniocentéza (AMC - amniocentesis) - jde o odběr vzorku plodové vody. Provádí se nejčastěji od 16. do 20. týdne těhotenství. V současnosti jde o nejčastěji používanou metodu invazivní prenatální diagnostiky v ČR.

Kordocentéza (CC - cordocentesis) - jde o punkci pupečníku a odběr vzorku fetální krve. Provádí se po 20. týdnu těhotenství.

Klasické vyšetření karyotypu

Klasické vyšetření karyotypu (hodnocení barvených metafázických chromozomů v optickém mikroskopu) vyžaduje kultivaci získaných buněk ve speciálním médiu, což výrazně prodlužuje dobu, která uplyne mezi samotným odběrem vzorku a vydáním výsledku. V případě amniocentézy či odběru choriových klků je nutné počítat v průměru s minimálně dvoutýdenní lhůtou (výsledky CVS bývají obecně o něco dříve díky většímu růstovému potenciálu choriových buněk). V určitých případech se čekání může protáhnout i na tři týdny. Kordocentéza má v tomto případě značnou výhodu rychlého zpracování vzorku (obecně jen několik dní), neboť je odebírána fetální krev (velký růstový potenciál lymfocytů).

Nicméně klasické vyšetření karyotypu pomocí standardních pruhovacích technik bylo (a troufnu si říci, že stále je) základní metodou vyšetření karyotypu (nejen) v rámci prenatální diagnostiky chromozomálních aberací. Jeho nespornou výhodou je možnost prohlédnout celý karyotyp, zhodnotit strukturu každého jednotlivého chromozomu - a samozřejmě i jejich počet. Nevýhodou je (mimo časové náročnosti) omezená schopnost detekovat určité chromozomální přestavby malého rozsahu (například mikrodelece), určovat původ marker chromozomů apod. V této oblasti pak nastupují metody molekulární cytogenetiky jako je například FISH (fluorescent in-situ hybridization - fluorescenční in-situ hybridizace).

QFPCR - nová metoda

QFPCR neboli kvantitativní fluorescenční polymerázová řetězová reakce (Quantitative Fluorescent Polymerase Chain Reaction) je speciální aplikací klasické PCR metody, sloužící k namnožení definovaného úseku DNA. V rámci prenatální diagnostiky se lze také setkat s označením amnioPCR (v souvislosti s amniocentézou - jako metodou, použitou k získání vzorku). Tato metoda umožňuje vyloučit / potvrdit numerické odchylky vybraných chromozomů a to v extrémně krátkém časovém období jednoho, maximálně dvou dnů. Nejčastěji jde o chromozomy, jejichž numerické abnormality tvoří většinu (cca 75 % prenatálně detekovaných chromozomálních aberací v ČR v posledních pěti letech) chromozomálních aberací: 13, 18, 21, X a Y.

Vlastní postup této metody je relativně jednoduchý. Stejně jako pro klasické cytogenetické vyšetření je potřeba získat vzorek buněk plodu. V tomto případě nejde o vyšetření cytogenetické, ale o DNA analýzu. Ze vzorku se tedy pomocí některé ze standardních metod nejprve izoluje DNA. Pro vlastní PCR metodu jsou připravené speciální „kity" s fluorescenčně značenými primery. Tyto primery ohraničují specifické lokusy na příslušných chromozomech (13, 18, 21, X a Y), které se pro potřeby této metody též označují jako markery. Jedná se o takové úseky, které obsahují vysoce polymorfní sekvence mikrosatelitní DNA - krátké tandemové repetice STR (Short Tandem Repeats). Délka těchto sekvencí je tedy vysoce variabilní, což je pro diagnostiku velmi výhodné. Provedení vlastní PCR je monitorováno v reálném čase (real-time), množství namnoženého produktu se zobrazuje na monitoru jako tzv. píky. Sleduje se výsledek reakce pro každý lokus zvlášť - pokud jsou přítomné dva píky o stejné výšce, jsou přítomné dva chromozomy a příslušný lokus má na každém odlišnou délku. Pokud jsou přítomné tři různé píky, znamená to přítomnost tří různých chromozomů, na kterých má variabilní lokus pokaždé odlišnou délku - takovýto výsledek svědčí pro trizomii příslušného chromozomu. Pro trizomii ovšem svědčí i přítomnost dvou píků, pokud je jejich výška v poměru 2:1. V tomto případě jsou přítomné dva stejné chromozomy (vyšší pík) a jeden odlišný - s odlišnou délkou příslušného lokusu (nižší pík). Pokud je délka lokusu na obou (respektive všech) chromozomech stejná - je přítomen pouze jeden pík a vyšetření pro tento lokus - marker není zcela informativní (z tohoto důvodu je pro vyšetření využíváno hned několika markerů na každém z vyšetřovaných chromozomů).

Díky QFPCR tedy můžeme poměrně přesně odhadnout počty sledovaných chromozomů a odhalit tak jejich numerické abnormality. Dnes se již ukazuje, že tato metoda je vysoce spolehlivá a dokáže při správném použití odhalit naprostou většinu numerických abnormalit chromozomů 13, 18, 21, X a Y. Existují proto hlasy, které navrhují v detekci numerických chromozomálních aberací přejít pouze na vyšetření pomocí QFPCR a zcela vyřadit klasickou karyotypizaci (dnes je stále zvykem po QFPCR provést i klasickou karyotypizaci - k potvrzení výsledku). V určitých případech, by takový přístup byl pravděpodobně přínosný. Jde o situace, kdy například biochemické i ultrazvukové screeningové vyšetření poukazuje na velmi vysoké riziko například Downova syndromu. Pokud je pak trizomie chromozomu 21 potvrzena i pomocí QFPCR, není již pravděpodobně přínosné čekat zmíněné dva týdny na definitivní potvrzení diagnózy. Na druhou stranou je QFPCR vyšetření svými možnostmi poněkud limitované. Oproti klasické karyotypizaci se nedokáže vyjádřit k numerickým abnormalitám jiných chromozomů, než které jsou součástí příslušného QFPCR kitu. Dalším nedostatkem je nemožnost identifikovat strukturní chromozomální aberace - například inverze nebo translokace. Problémy mohou nastat rovněž s abnormalitami, které se budou vyskytovat ve formě chromozomální mozaiky.

Je tedy jasné, že QFPCR není zcela plnohodnotnou náhradou za klasické vyšetření karyotypu - neboť nedokáže identifikovat všechny typy abnormalit jako klasické vyšetření karyotypu. Není tedy indikována ve všech případech, a její použití záleží na uvážení klinického genetika. V současné době se toto vyšetření indikuje většinou v těch případech, kde je buď nebezpečí z prodlení (například odběr plodové vody po 22. týdnu těhotenství) nebo v případě vysokého rizika vrozené chromozomální aberace pro plod (pozitivní screening s vyšším rizikem než 1:100). Nicméně jako tzv. „rychlá diagnostika" je toto vyšetření velice přínosné, neboť dokáže podat základní informaci o přítomnosti / nepřítomnosti nejčastějších numerických chromozomálních aberacích a to ve velmi krátkém čase.

Autort: Antonín Šípek

Literatura
1.Calda, P. et al.: Ultrazvuková diagnostika v těhotenství (Pro praxi). Aprofema, Praha, 2007, 268 s.
2.Gregor V., Šípek A., Šípek A. jr., Horáček J., Langhammer P., Petržílková L., Calda P.: Prenatální diagnostika chromozomálních aberací Česká republika: 1994 - 2007;
Čes. Gynek.2009, 74, č. 1 s. 44-54
3.Šípek A., Gregor V., Šípek A. jr., Horáček J., Langhammer P., Petržílková L., Wiesnerová J.: Vrozené vady v České republice v roce 2006; Čes. Gynek.2008, 73, č. 6 s. 331-340