Produkce laktoferinu mateřského mléka pro farmaceutické a výživové účely

Laktoferin je bílkovina přítomná v mléce, jejíž biologické účinky jsou nezbytné pro novorozence a o jejímž použití se uvažuje v léčbě některých typů nádorů.  Kde ho získat?  Z pochopitelných důvodů není možné tuto bílkovinu izolovat z jejího přirozeného zdroje, lidského mateřského mléka. A jak bude rozebráno později, ačkoliv je základní struktura i funkce laktoferinu mezi savci stejná, rozdíly existují. Proto se hledá alternativní modelový organismus, který v produkci lidského laktoferinu poskytne nejlepší výsledky a stane se jeho náhradním zdrojem.

O laktoferinu obecně

Laktoferin je esenciální složkou mateřského mléka, které ovlivňuje vývoj orgánů a fyziologii novorozence. Jeho typickým znakem je schopnost reverzibilně vázat atomy železa. Přestože se zprvu myslelo, že laktoferin je výhradně „mléčný" protein, byl později objeven i v slzách, slinách, žluči, pankreatických štávách a semeni. Je vylučován mukózou dýchacího a trávicího traktu nebo neutrofily (typ bílých krvinek).

Za hlavní funkci lze považovat dynamickou vazbu iontů železa v závislosti na jeho množství v organismu a jeho transport v tenkém střevě. Byly prokázány antibakteriální, protirakovinné a protizánětlivé účinky laktoferinu. Uvedené schopnosti vyvolávají snahu o hlubší pochopení funkce pro další využití v potravinářském a farmaceutickém průmyslu.  Produkce laktoferinu z kravského mléka (bLF) začala v některých zemích již před dvaceti lety, s uplatněním v kojenecké výživě, jogurtech nebo kosmetice. Přesto není doposud známo, jestli je ve všech ohledech funkce kravského laktoferinu stejná jako funkce laktoferinu lidského. Bylo například pozorováno, že lidský laktoferin se váže na jiná místa ve střevě kojenců než kravský. Právě proto by bylo užitečné naučit se produkovat lidský protein v geneticky modifikovaných  organismech.

Hlavní problém? Cukry!

Proteiny prochází po své syntéze řadou úprav. Jednou z nich je glykosylace, při níž jsou na aminokyselinovou kostru připojovány cukry, a tím může být dosaženo pozměnění vlastností proteinu. A tady nastává problém. I když je primární struktura savčích laktoferinů velmi podobná, odlišnost nastává v cukerných zbytcích, které jsou na proteiny navázány.

Současné úspěchy a neúspěchy v produkci rekombinantního laktoferinu

To, jaký je o laktoferin zájem, je patrné z množství různých druhů organismů, ve kterých se o jeho produkci snaží výzkumné skupiny po celém světě (review Conesa et al., 2010).

Již v roce 1993 s úspěchem získala rekombinantní lidský laktoferin (rhLF) z kvasinky Saccharomyces cerevisiae laboratoř Lianga a Richardsona (Liang a Richardson et al., 1993). Bohužel v poměrně nepatrném množství 1,5 - 2 mg proteinu v litru kvasinkové kultury. Ke komerčnímu využití technologie nedošlo.

O rok dříve byly Wardem publikovány práce, ve kterých se podařilo extracelulárně produkovat rhLF v plísních Aspergillus oryzae a Aspergillus nidulans (Ward et al., 1992). Gen lidského laktoferinu byl plísním vložen na místo genu pro protein, který je produkován ve velkém množství.  Oproti kvasinkám tak A. oryzae produkovalo do média více než desetinásobek rhLF. V návaznosti na úspěch s A. oryzae došlo k vylepšení s A. awamori až na 2g/L (Ward et al., 1995). Takto vyprodukovaný protein byl porovnáván s přirozeným lidským proteinem a úspěšně prošel v testech vazby na specifické buňky, antibakteriální aktivity, vazby železa, pasterizačními protokoly i strukturními studiemi. Drobnohledu provedených analýz ale neušly rozdíly v zastoupení cukrů navázaných na rekombinantní laktoferin, které však v tomto případě neměly významný biologický efekt. Dobrou zprávou je, že laktoferin z A. awamori nachází komerční využití a je ve fázi testování pro gastrointestinální a dermatologické aplikace. Navíc je zkoumán jeho pozitivní účinek v souvislosti s léčbou rakoviny prostaty, prsu, vaječníků, slinivky a od roku 2009 je součástí léků proti renálním nádorům ledvin.

Mezi další využité organismy patří několik druhů kvasinek, mykobakterium, protein byl produkován v mléce koz, krav, myší, králíků, rajčatech, bramborách, obilovinách. Pro shrnutí lze říct, že se vědci potýkají především s problémem odlišné modifikace proteinu glykosylací, a tím mírně změněnou aktivitou. Zanedbatelný není ani problém množství získaného produktu, složitost jeho další úpravy a přečišťování, což se dále bude odrážet v cenové dostupnosti přípravků.

Mléčná rýže?

Problém odlišné glykosylace se nevyhýbá ani rostlinám. Dá se říct, že právě naopak. Rostliny připojují na své proteiny jiné cukry, tudíž nevzniká rozdíl jen v kvantitě (na rozdíl od kravského mléka), ale i v kvalitě. Přesto bylo dosaženo značných úspěchů v antimikrobiálních testech rekombinantního laktoferinu produkovaného v rýži (Conesa et al., 2010; Nandi et al., 2005). Samozřejmě byly provedeny i pasterizační testy, které ukázali, že vysoká teplota aktivitu proteinu neovlivní, tudíž je možné rýži před konzumací klasicky vařit. Výhodou je hypoalergičnost rýže, která umožňuje její využití v kojenecké výživě.

Výhody získávání lidského laktoferinu z modifikovaných organismů jsou tedy zjevné. Lidský laktoferin, se svou doposud ne přesně popsanou schopností využitelnou v léčbě nádorů, může být produkován v široké škále organismů, které ho modifikují cukernými zbytky. Tato modifikace je pak hlavním rozdílem od přirozeného lidského proteinu. To, jestli jsou jednotlivé pro biologickou funkci významné, je prozatím předmětem testů a výzkumu. Se současnými znalostmi se však zdá, že první aplikace pro farmaceutické a výživové účely jsou již za dveřmi.

-MJ-

Zdroje:

CONESA, C., CALVO, M. & SÁNCHEZ, L. 2010. Recombinant human lactoferrin: A valuable protein for pharmaceutical products and functional foods. Biotechnol Adv. [Epub ahead of print]

LIANG Q, RICHARDSON T. Expression and characterization of human lactoferrin in yeast Saccharomyces cerevisiae. J Agric Food Chem 1993;41:1800-07.

NANDI, S., YALDA, D., LU, S., NIKOLOV, Z., MISAKI, R., FUJIYAMA, K. & HUANG, N. 2005. Process development and economic evaluation of recombinant human lactoferrin expressed in rice grain. Transgenic Res, 14, 237-49.

WARD PP, LO JY, DUKE M, MAY GS, HEADON DR, CONNEELY OM. Production of biologically active recombinant human lactoferrin in Aspergillus oryzae. Biotechnology (N Y) 1992a;10:784-9.

WARD PP, MAY GS, HEADON DR, CONNEELY OM. An inducible expression system for the production of human lactoferrin in Aspergillus nidulans. Gene 1992b; 122:219-23.

WARD PP, PIDDINGTON CS, CUNNINGHAM GA, ZHOU X, WYATT RD, CONNEELY OM. A system for production of commercial quantities of human lactoferrin: a broad spectrum natural antibiotic. Biotechnology (N Y) 1995;13:498-503.