Hlavní strana Autorské články a zajímavosti ze světa biotechnologií Přelomový systém detekce intracelulárních patogenů

Přelomový systém detekce intracelulárních patogenů

Datum: 14.6.2012

Intracelulární patogeny patří mezi obzvláště zákeřné biologické faktory způsobující onemocnění hostitele. V laboratoři se velice neochotně množí a některé zástupce dokonce považujeme za prakticky nekultivovatelné (Votava a kol. 2003). Mycobacterium avium spp. paratuberculosis (MAP) je vnitrobuněčný parazit, který uniká imunitnímu systému hostitele tím, že se schovává v periferních bílých krvinkách, zejména makrofázích a dendritických buňkách. U hovězího dobytka způsobuje paratuberkulózu. Jedná se o nakažlivé onemocnění střeva, které bývá chronické a často i fatální (Wikipedia). Prevalence ve stádech skotu v Evropě se liší v rozmezí 7-55% (Manning a Collins 2001). Infikovaný dobytek vylučuje MAP v mléce a zdá se, že ani podmínky běžně používané pro pasterizaci tj. 72°C, 15s nebo 25s MAP nezničí, pouze sníží jeho počet. Bakterie navíc úspěšně přežívá v okolním prostředí, zejména ve vodě. Proto není vyloučen přenos na člověka při koupání v přírodních vodách v blízkosti pastvin parazitem nakaženého skotu. MAP je velice odolné a nemusí být zničeno ani při přípravě pitné vody, protože k jeho likvidaci je zapotřebí několikanásobně vyšší množství chlóru než k usmrcení E. coli.

U člověka byl MAP opakovaně izolován z tkání pacientů postižených Crohnovou nemocí a dává se s ní proto do přímé souvislosti. Jedná se o systemické onemocnění celého trávicího traktu od úst až po konečník. Objevují se vředy, nejčastěji v tlustém střevě, kde může dojít až ke srůstům a perforacím. Nemoc se projevuje celkovým pocitem slabosti, bolestmi v abdominální oblasti, nočním pocením, někdy s bolestmi kloubů a vředy v ústech. 60% pacientů trpí průjmem, občas krvavým. Léčba se většinou omezuje na potlačování zánětlivého procesu. K relapsům dochází nejčastěji v souvislosti s psychickým nebo fyzickým vypětím. Postupně dochází k chirurgickému odstraňování srůstů a perforací střeva, které je nakonec u 40% pacientů nahrazeno vývodem. I v případě, že jsou pacientovi podávána antituberkulotika jako klarithromycin nebo rifabutin, je velice obtížné bakterii z těla trvale odstranit.

Vzhledem k tomu, že je bakterie v těle ukryta před imunitním systémem, není možné pro její detekci použít sérologické metody (metody detekující protilátky). Místo nich spočívá klasická metoda detekce patogena v časově náročné kultivaci, která může trvat i dvanáct týdnů. Často se ke kultivaci používají leukocyty izolované z krve. Ne vždy se ale kultivace patogenního agens podaří. Důvody neúspěchu jsou různé, od neochoty konkrétního izolátu růst v kultuře, až po přítomnost různých interferujících biologických látek v klinickém vzorku. Po kultivaci následuje pracná příprava čisté DNA a identifikace patogenního agens pomocí nested PCR (nPCR). Taková časová prodleva neúměrně prodlužuje diagnózu a snižuje tak možnosti včasné léčby. Samozřejmě je také finančně náročná, a to jak z hlediska času, tak z hlediska PCR reagencií. Potřeba vyvinout efektivnější diagnostický systém je proto neoddiskutovatelná.

Zdá se, že nový postup se nedávno podařilo vyvinout americkým vědcům z univerzity v Orlandu. Systém je založený na relaxovaných magnetických nanočásticích (MRS), na kterých je připojen oligonukleotid specifický pro oblast genomu IS900. Ten se vyskytuje pouze u MAP, a proto nejeví žádnou zkříženou reaktivitu s jinými mykobakteriemi. Pomocí MRS lze detekovat i antigeny, pokud na ni připojíme protilátku. Částice jsou tvořeny oxidem železa pokrytým polymerem a mají průměr 78+/-3nm. Průměrně je na částici připojeno 55 oligonukleotidů. K detekci se používá stolní relaxometr a lze použít jen minimálně zpracovanou krev, která prošla cykly zahřátí a zchlazení. Po navázání sondy na cílovou sekvenci v genomu patogena je možné měřit změnu v nukleární magnetické resonanci (konkrétně relaxační čas vodního protonu T2). MRS mají velkou výhodu oproti jiným metodám, které používají nanočástice jako značky nebo k měření přímých fyzikálních vlastností např. změny magnetického pole. Protože u MRS metody dochází k amplifikaci signálu, T2 je měněn stovkám molekul obklopujících částici. Částice jsou extrémně stabilní v médiu se sérem a nepodléhají interakcím s proteiny séra ani s nukleázami, zřejmě díky vysoké koncentraci solí dané hustou přítomností DNA řetězců. Proto mohou částice detekovat patogeny i v zakalených a minimálně procesovaných klinických vzorcích.

Funkčnost technologie byla testována na 60 vzorcích krve pacientů s Crohnovou nemocí a zdravých jedinců. Vzorky byly porovnány s výsledky získanými pomocí nPCR zpracováním stejných vzorků. Na test byla použita jak DNA připravená tepelným rozpadem buněk, obsahující řadu nečistot, tak i super čistá DNA připravená pracným mnohokrokovým protokolem. Částice se na oba vzorky DNA navázaly během 30 minut. Změny v relaxačním čase vodíkových protonů byly závislé na koncentraci DNA ve vzorku. MRS byla schopná detekovat jedinou kópii DNA patogena do jedné hodiny, zatímco nPCR zachytila MAP až od 5 bakterií v druhém cyklu PCR. Navíc nPCR nebyla schopná identifikovat vzorky s nahrubo připravenou DNA. Z deseti testovaných vzorků byl jeden pozitivní na MRS a přitom negativní pomocí nPCR. Vzorek byl dále kultivován a posléze potvrzen jako pozitivní.

Kromě vyšší citlivosti předčí MRS nPCR i cenou. Samozřejmě je možné jejich použití rozšířit na detekci dalších druhů vnitrobuněčných parazitů. Proto vědci předpokládají, že tato metoda brzy nalezne v klinické praxi širokou oblibu (Kaittanis a kol. 2012).

Autor: RNDr. Klára Kazdová

Líbil se Vám tento článek? Doporučte jej svým známým.