Hlavní stranaAutorské články a zajímavosti ze světa biotechnologiíLinDA - tisíckrát citlivější namnožení analyzované...

LinDA - tisíckrát citlivější namnožení analyzované DNA

Datum: 19.9.2011 

Když chcete analyzovat DNA, tak si ji nejprve musíte izolovat a namnožit, abyste s ní mohli dál pracovat. Zní to jednoduše, ale bývá to docela dřina, doprovázená mnoha komplikacemi. Nezřídka je k dispozici pouze směšné množství DNA a její zpracování vyžaduje schopnosti přinejmenším špičkového kouzelníka. Právě v tomto směru by teď měla molekulárním vědcům usnadnit život nová technologie namnožení zkoumané DNA, která je podle popularizačních titulků tisíckrát citlivější, než doposud používané metody.

S novou technologií lineární amplifikace DNA, poeticky zkracované jako LinDA, přichází mezinárodní tým odborníků, seskupený kolem Hinricha Gronemeyera z Institute of Genetics and Molecular and Cellular Biology ve Štrasburku. S touto metodou je prý možné spolehlivě namnožit tisíckrát menší množství DNA, než bylo možné donedávna, například z kmenových buněk, buněk mladých rakovinných nádorů, z malých vzorků rostlinných či živočišných tkání a také ze vzorků získaných při archeologickém výzkumu. Ve všech těchto případech je samozřejmě k dispozici jen velmi omezené množství genetického materiálu, jehož získání bylo až doposud často na samotné hranici možností těch nejlepších laboratoří světa.

Hlavní rozdíl mezi LinDA a dosavadními postupy množení DNA, založenými na slavné PCR technologii (čili polymerázové řetězové reakci), spočívá ve způsobu kopírování sledovaných molekul DNA. PCR metody zvládají nakopírovat pouze fragmenty cílové DNA, vytyčené dvěma primery. Háček je v tom, že se primery, obsahující více guaninu a cytosinu, váží na sledovanou DNA při vyšších teplotách, než je tomu u primerů s vyšším obsahem adeninu a thyminu. Proto jsou oblasti DNA s vyšším obsahem guaninu a cytosinu během PCR množeny častěji. Metody množení DNA založené na PCR tedy trpí sklonem preferovat kousky DNA bohaté na guanin a cytosin, což se během LinDA neděje.

Kopírování DNA je při PCR exponenciální, zatímco LinDA, jak už samotné jméno této technologie napovídá, množí DNA lineárně, zároveň ale s mnohem vyšší citlivostí. Při množení DNA metodou LinDA je na začátek a konec všech molekul DNA v analyzovaném vzorku připojen speciální kousek virové DNA - takzvaný T7 promotor, který si badatelé vypůjčili od bakteriofága T7, napadajícího většinu kmenů slavné bakterie E. coli. Poté se technologií LinDA kopírují stále znovu pouze takto označené molekuly původní DNA, kdežto při množení DNA polymerázovou řetězovou reakcí se kopírují i nově vzniklé kopie, kterých pak exponenciálně přibývá.

Nahlédnutí do kuchařky LinDA prozradí, že kousky DNA, označené T7 promotorem, jsou po 16 hodin ve 37 stupních Celsia přepisované bakteriofágovou T7 RNA polymerázou. Takto získaná RNA je posléze vystavena působení koktejlu z Taq polymerázy, nespecifické endonukleázy RNázy H a Pfu polymerázy, pocházející ze zajímavého horkomilného archaea Pyrococcus furiosus, oblibujícího teploty kolem 100 stupňů Celsia.

Jak je vidět, i LinDA v určité míře využívá klíčový enzym PCR - Taq DNA polymerázu, pocházející z teplomilné bakterie Thermus aquaticus, objevené v horké geotermální vodě Yellowstonského národního parku. Tahle bakterie si nejvíc užívá teploty prostředí kolem 70-80 stupňů Celsia a její Taq polymeráza, odolná vůči vysokým teplotám, se proto před časem velmi hodila pro účely PCR, která funguje díky střídání nízkých a vysokých teplot. Nicméně, LinDA pracuje i s Pfu DNA polymerázou, která je sice pomalejší, ale za to je ještě odolnější vůči vysoké teplotě a také preciznější. Komerčně dostupné Pfu polymerázy udělají v průměru 1 chybu na 1,3 miliónu párů bází. Zároveň je tento enzym nesmírně zajímavý tím, že svojí sekvencí není příbuzný jiným známým DNA polymerázám a je tudíž pro vědu unikátní novinkou.

Gronemeyer a spol. vyvinuli technologii LinDA především jako velmi precizní metodu zpracování DNA pro ChlP-Sequencing (Chip-Sequencing), tedy analýzu transkripčních faktorů v měřítku celých genomů, která kombinuje imunoprecipitaci chromatinu s masivním paralelním čtením množství fragmentů DNA. ChlP-Sequencing potřebuje nanogramová množství sledované DNA, tedy deset na mínus devátou gramu a technologie LinDA takové množství zajistí z pikogramových vzorků DNA, čili v řádech deset na mínus dvanáctou gramu.

Autor: RNDr. Stanislav Mihulka PhD., PřF JU, České Budějovice


Použité zdroje:

Originální studie: (orig.) Wageningen University 9.června 2011, Single-tube linear DNA amplification (LinDA) for robust ChIP-seq. Nature Methods 8: 565-567.

Připraveno podle: PsychOrg: New DNA analysis thousand times more sensitive

Další použitá literatura:

Wikipedia (Chip-Sequencing, Pfu DNA Polymerase)

Obrazové přílohy:

Kredit: Wageningen University.

http://www.wur.nl/NR/rdonlyres/C0231614-F7DD-4D8F-9E58-77AF5F8376C8/141198/fingerprint300x225.jpg

Chl-P Sequencing. Kredit: Chris Taplin, Wikimedia Commons.

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/thumb/f/fb/Chip_sequencing2.png/800px-Chip_sequencing2.png

Hypertermofilní elegán Pyrococcus furiosus. Kredit: Sciencescapes.

http://sciencescapes.co.uk/wp-content/uploads/2010/10/Pyrococcus_furiosus.jpg


68

Komentáře / diskuse


Váš komentář:







 

OPPI, MPO, EU

CEBIO a I. etapa JVTP

  • CEBIO
  • BC AV CR
  • Budvar
  • CAVD
  • CZBA
  • Eco Tend
  • Envisan Gem
  • Gentrend
  • JAIP
  • Jihočeská univerzita
  • Madeta
  • Forestina
  • ALIDEA

Provozovatel

Jihočeská agentura pro podporu inovačního podnikání o.p.s.

Články na přání


[načítám anketu]

LinkedIn