Léčba hepatitidy C pomocí moderní metody RNA interference

Virové hepatitidy jsou zánětlivá onemocnění jater, která jsou narozdíl od hepatitid nevirového původu nakažlivá. Nejrozšířenějšími typy jsou hepatitidy (žloutenky) typu A, B a C. První příznaky, jako jsou malátnost, bolesti kloubů a svalů, často připomínají spíše chřipku. Nejsou tak výrazné a typické, aby nakaženého donutili vyhledat lékařskou pomoc. Viditelné zežloutnutí kůže, bělma a tmavá moč se u většiny nakažených neobjeví a tak jsou jedinou cestou jak odhalit onemocnění krevní testy. Na ty však dochází až pro rozvinutí onemocnění, během jehož inkubační doby se virus může bez vědomí nakaženého přenášet. Proti hepatitidám „A" a „B" existuje účinná vakcína.

Vakcína proti hepatitis C neexistuje a současná medicína nemá v rukou dostatečný prostředek pro její léčbu s ohledem na toxicitu a účinnost. Aplikace interferonu alfa a ribavirinu může vyvolat vedlejší účinky jako jsou deprese, hemolytické anémie nebo horečky. Právě proto je výzkum v této oblasti velmi dynamický a snaží se využít nových poznatků molekulární biologie, které umožňují díky pochopení mechanismu onemocnění sofistikovanější přístup. Virem hepatitidy C (HCV) je v současnosti na světě chronicky infikováno přibližně 350 milionů lidí.

RNA interference je teprve několik let známý mechanismus přirozené obrany buněk proti virovým nákazám a hraje také důležitou roli při posttranskripční regulaci genové exprese. Její objev způsobil obrovskou revoluci v mnoha odvětvích molekulární biologie, genetiky a biochemie. Základním předpokladem interference je transkripce RNA, která je komplementární k molekule RNA určené pro degradaci. Tyto malé interferující RNA (siRNA) přepisované z genomu a zpracovány na molekuly o velikosti cca 20 nukleotidů interagují s komplexem proteinů a vytváří RISC (RNAi silencing complex). Po rozeznání komplementární molekuly RNA komplexem RISC v cytoplazmě buňky dochází k její degradaci.

http://cs.wikipedia.org/wiki/RNA_interference

Genetická informace HCV je uložena v jediné molekule RNA o velikosti 9,6 kb. Polyprotein translatovaný pomocí aparátu hostitele je kotranslačně a posttranslačně rozštípán virovými a hostitelovými proteázami na 10 jednotlivých proteinů. Oblast čtecího rámce polyproteinu je ohraničena z obou stran UTR (netranslatovanými sekvencemi), důležitými pro replikaci RNA viru. Jedním z hlavních problémů při vývoji antivirotik je variabilita genomu virů a následně i antigenních vlastností. U HCV je variabilita způsobena velkou chybovostí RNA dependentní RNA polymerázy, která generuje mutace ve strukturních i funkčních proteinech viru. Tato na první pohled nedokonalá strategie udržuje genomovou plasticitu a díky ní nelze jednoduše vyvinout účinnou vakcínu.

Vědecké týmy se snaží vyvinout terapii založenou na aplikaci RNA komplementární k oblastem HCV s konzervativní sekvencí. Proti jaké sekvenci má být interferující RNA zaměřena, aby nedošlo k selekci rezistentních jedinců? Jak selektivně transportovat molekuly RNA do postižených buněk? Je vhodnější využití DNA vektorů nesoucích genetickou informaci pro prekurzory interferujících RNA transkribovaných až v buňkách nebo hotové siRNA? Jak omezit imunitní odpověď organismu na cizorodou RNA a nehrozí nežádoucí vedlejší účinky?

Lidský organismus reaguje na vpravení molekuly dsRNA delší než 30bp imunitní odpovědí, která má za následek aktivaci interferonem (IFN) stimulovaných genů. Exprese těchto genů v konečném důsledku způsobí nespecifickou degradaci RNA, inhibici translatace a buněčnou smrt. In vivo experimenty provedené v roce 2003 se syntetickými siRNA a shRNA (shRNA = short hairpin RNA = prekurzory siRNA) vykazovaly také částečnou IFN odpověď. Přitom ty, které byly aplikovány ve formě vektoru byly v tělních tekutinách mnohem stabilnější. Snahou je práce s co nejmenšími, ale ještě dostatečně specifickými RNA pro minimalizaci nežádoucích účinků. To se podařilo při práci s molekulami o velikosti 21 nukleotidů, kdy nebyla pozorována žádná negativní imunitní odpověď. Výhodou delších interferujících RNA je, že mohou být přenášeny v nižších koncentracích. Při hledání oblasti na mRNA proti níž navrhujeme siRNA je také důležité brát ohled na tvorbu sekundární struktury, které snižuje účinnost RNA interference nedostupností místa pro RISC komplex.

Tak jako při léčbě antibiotiky hrozí i u RNAi selekce rezistentních mutantů. Selekční tlak na virus se podařilo minimalizovat použitím shRNA zpracovávající se do siRNA proti více konzervativním oblastem genomu najednou (UTR i proteiny kódující oblasti). Jinou možností je zaměřit RNAi proti mRNA hostitele, jejíž translační produkt je pro virus esenciální a jeho snížená exprese vážně neovlivní standardní metabolismus buňky. Kombinací terapie proti viru a některým buněčným RNA lze dosáhnout velmi dobrých výsledků. Efekt siRNA vymizí po přirozené degradaci RNázami za 3-7 dní. Poslední testy nevykazovaly žádné vedlejší účinky.

Dalším úskalím terapie je selektivní doprava siRNA a její ochrana před degradací v průběhu transportu. Chemickou modifikací některých částí molekuly RNA lze dosáhnout její ochrany před nukleázami, zatímco nosiče na bázi lipidů, nebo biodegradovatelné kationtové nosiče zajišťují s využitím přirozených biochemických cest specifický transport bez potřeby zavádění přetrvávajících cizorodých materiálů. Jak již bylo zmíněno, RNA může být aplikována ve dvou různých formách. Jako hotový produkt přirozené maturace transkriptu nebo ve formě vektoru kódujícího vlásenku, z něhož je v hostitelské buňce průběžně syntetizován meziprodukt, který potřebuje další zpracování. Výhodou vlásenkové formy je, že díky průběžné syntéze je účinek terapie dlouhodobější a účinná koncentrace RNA je nižší, protože z jednoho vektoru je možná syntéza více vlásenek.

Ačkoliv zavedení RNAi terapie vyžaduje hlubší biochemické a molekulárně biologické znalosti, její zvládnutí dává medicíně obrovské možnosti pro léčbu virových onemocnění a onemocnění způsobených disregulací genové exprese. Hlavními výhodami je extrémní selektivita a tím i šetrnost léčby, jejíž vedlejší účinky jsou minimalizovány. Přímým nasměrováním přípravku proti patogenu se zvyšuje i účinnost terapie.

Autor: Martin Jacko

Zdroje:

Saba Khaliq, Sadaf A. Khaliq, Muzna Zahur, Shah Jahan, Bushra Ijaz, Sajida Hassan, Sheikh Riazuddin. RNAi as a new therapeutic strategy against HCV. Biotechnology Advances 2009.08.004

SHin D, LeeH, Kim SI, Yoon Y, Kim M. Optimization of linear double-stranded RNA for the production of multiple siRNA targeting hepatitis C virus. RNA 2009;15

Inhibition of hepatitis C virus gene expression by small interferony RNAs usány a tris-cistronic full lenght viral replicon and a transient mouse model. Virus Res 2006;12

cs.wikipedia.org/wiki/RNA_interference

www.hep.cz

www.hepatitis.cz