Inzulín – superstar v biotechnologii

Inzulínem to vlastně všechno začalo. Poté, co v roce 1973 Herbert W. Boyer a Stanley N. Cohen zveřejnili na Gordonské konferenci v New Hampshire úspěšný přenos živočišného genu do Escherishia coli, předložila firma Eli Lilly & Co 24. května 1976 v Indianopolis přítomným vědcům, kteří se tam sešli na malé konferenci, svůdnou návnadu: připravte lidský inzulín metodou genového inženýrství.

Nešlo o maličkost. Světový trh inzulínu se blížil miliardě USD. Je známo, že běžný inzulín se připravuje extrakcí z vepřových slinivek, ale má to háček: Lidský inzulín se liší od prasečího v jedné z jednapadesáti aminokyselin. Citliví pacienti na to reagují. Chemická úprava je obtížná a tedy i nákladná. Proto firma, která by získala zdroj levného lidského inzulínu, by měla zlatý důl.

Za ambiciózním cílem se pustily tři skupiny: kromě Herberta Boyera, průkopníka přenosu genů i tým Waltera Gilberta z Harvardovy university. S Boyerovou skupinou z Kalifornské univerzity v San Francisku spolupracoval Arthur Riggs z City of Hope (později firma Genentech) a tým Williama Ruttera a Howarda Goodmana.

Walter Gilbert (Nobelova cena 1980 za sekvenování s Frederick Sangerem a Paul Bergem) měl přesně rozmyšlený plán: hodlal jít klasickým postupem tehdejší molekulární biologie. To znamená chtěl izolovat z lidských buněk tvořících inzulín přenašečové mRNA, která nese kód pro základní peptidy inzulínu, a podle ní pak reversní transkriptázou připravit kopii DNA. Tento úsek DNA by tudíž odpovídal sekvenci lidského genu pro inzulín. Pak už jen zbývá ho metodou Boyera a Cohena vpravit pomocí plasmidu do bakterie a doufat, že ta se dá ošálit a podle tohoto cizího genu bude syntetizovat lidský inzulín.

Plán klasický, ale právě proto byl lovnou zvěří pro byrokracii: v USA v té době bylo zakázáno (i tam se tehdy světilo božstvo předběžné opatrnosti) přenášet lidské geny jinde než v P4 laboratoři, což byla natolik zabezpečená laboratoř, že ji vlastnili jen vojáci ve Fort Detricku k výzkumu biologických zbraní. A ti ji nepůjčili. Celý tým se musel 1. září 1978 přesunout do Portonu, neboť britská armáda byla vstřícnější.

V roce 1974 potkalo kalifornskou skupinu osudové štěstí. Přihlásil se jim dvaatřicetiletý Japonec Keiichi Itakura, který - v té době značně vychloubačně - tvrdil, že zvládá syntézu polynukleotidů nejlépe na světě. Štěstí bylo v tom, že Art Riggs, který s ním jednal, ho neposlal kamsi, jak by to mnoho jiných učinilo, ale přijal ho do týmu. Vsadil a vyhrál. Keiichi Itakura na třetí pokus připravil perfektní řetězce DNA, které sestavil David Goeddel - tehdy mladý postdok, později ředitel firmy - do celku identického s lidským genem inzulínu. Nebyla to maličkost; inzulín se skládá ze dvou řetězců o třiceti a jednadvaceti aminokyselinách, což při tripletovém kódu znamená 90 a 63 nukleotidů v řetězci (kromě zaváděcích úseků).
Zde komická tvář byrokrata sehrála kladnou úlohu: ačkoli tento řetězec byl identický s lidským genem pro inzulín, pro byrokrata to byla „chemikálie" a proto žádná omezení neplatila. Takže v noci z 23. na 24. srpna 1978 - tedy v době, kdy se Gilbertův tým připravoval do Portonu - získali Dennis Kleid a David Goeddel z bakteriální kultury oba řetězce inzulínu, úspěšně je spojili a přišlo na svět asi 20 ng lidského inzulínu vyrobeného genovým inženýrstvím. Moderní průmyslová biotechnologie byla na světě.

Dva roky před tím v lednu 1976 zavolal Boyerovi finančník Robert Swanson a následně v nedalekém baru oba založili firmu Genentech vložením (zlí jazykové tvrdí Boyer půjčených) 500 USD každý. Po úspěchu výroby lidského inzulínu z bakterií, učinila průmyslová výroba inzulínu firmou Genentech z Herberta Boyera nikoli nositele Nobelovy ceny, ale nejbohatšího molekulárního biologa.

Fermentační výroba lidského inzulínu tento preparát (nazvaný Humulin) učinila obecně dostupným, ale výroba není nejlevnější. Čištění musí být velice důkladné, aby se odstranily stopy nečistot bakteriálního původu. Proto se hledají, tak jako i u jiných léčebných peptidů, možnosti levnější výroby. Nejsnadnější by bylo využití transgenních rostlin. Již v roce 2000 se objevily takové studie (Leite A et al. (2000) Expression of correctly processed human growth hormone in seeds of transgenic tobacco plants. Mol. Breed. 6, 47-53 a Horvath H et al. (2000) The production of recombinant proteins in transgenic barley grains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 1914-1919). Čtyři roky nato už vznikl první inzulín „z rostlin" (Panahi M et al. (2004) Recombinant protein expression plasmids optimized for industrial E. coli fermentation and plant systems produce biologically active human insulin-like growth factor-1 in transgenic rice and tobacco plants. Transgenic Research 13, 245-259).
Letos probíhají v Kanadě už klinické zkoušky lidského inzulínu ze světlice barvířské (Carthamus tinctorius) zvané též saflor. Firma SemBioSys do této rostliny vpravila gen řídící syntézu proinzulínu, který se tvoří v semenech. Po izolaci se enzymaticky mění v inzulín. Firma provedla nezbytné předklinické zkoušky a na 30 dobrovolnících vyzkoušela účinnost. Na základě toho dostala povolení klinických zkoušek. Během letoška očekává jejich vyhodnocení a pak požádá o uvedení na trh.

Firma uvádí výtěžnost několika kilogramů z hektaru. Je zřejmé, že takto vyráběný lidský inzulín bude podstatně levnější než preparát získávaný fermentací pomocí bakterií. Pokud vše dobře dopadne, má firma naději na navrácení prostředků, které už skoro pět let do této výrobní metody investuje. Dnešní trh inzulínu se odhaduje na 7,1 miliardy USD a do roku 2012 se má zdvojnásobit.

Jinou výhodu představuje inzulín syntetizovaný v tabáku z vneseného transgenu. Tuto geneticky modifikovanou rostlinu vyvinul profesor Henry Daniell z University of Central Florida. Jeho trik je v tom, že inzulín neizoluje, rostlinný materiál zmrazí a dehydratuje a podává per os myším. Inzulínový peptid projde žaludkem uzavřen v rostlinných buňkách, takže trávicí enzymy ho nerozštěpí. Teprve ve střevě se z těchto buněk pozvolna uvolňuje a vstřebává. Kdyby tento postup fungoval tak, jak profesor Daniell předpokládá, diabetici by se zbavili nepříjemné injekční aplikace. V plánu má floridská skupina vyvinout podobně modifikovaný hlávkový salát, jelikož je vhodnější formou aplikace než tabák.

Autor: Jaroslav Drobník