Hlavní strana Autorské články a zajímavosti ze světa biotechnologií Geneticky upravená E. coli výrobcem prekurzoru cenného...

Geneticky upravená E. coli výrobcem prekurzoru cenného taxolu

Datum: 20.10.2010

Tisy byly už ve středověku nesmírně ceněnou surovinou strategického významu. Filip VI. Francouzský, první panovník z dynastie Valois a protagonista slavné bitvy u Kresčaku by mohl vyprávět. Když 26. srpna 1346 jeho neukáznění rytíři zaútočili přímo z pochodu na dobře připravené anglické vojsko pod velením krále Eduarda III. a jeho syna Eduarda, známého jako Černý princ, rozstříleli je angličtí lučištníci vybavení tisovými luky. V našich končinách je samozřejmě nejznámější legendární konec Jana Lucemburského, ale právě tisové luky v této a následujících bitvách, především 25. října 1415 u Azincourtu, přivolaly zásadní změny vojenské taktiky a soumrak středověkého rytířstva. Tis červený (Taxus baccata) je pro výrobu dlouhých luků jako stvořený, ale neroste příliš rychle a navíc bývá často příliš křivý. Není tedy divu, že ho v Anglii brzy vykáceli a přinejmenším od roku 1294 bylo nutné do Anglie tisové dřevo dovážet. Od té doby byl vlastně neustále tisového dřeva nedostatek, který se postupně rozšířil na prakticky celou Evropu a středověké šílení kolem tisu ukončilo až zavedení palných zbraní do výzbroje armád.

Je pozoruhodné, že se dnes velmi podobná situace opakuje pro tis západoamerický (Taxus brevifolia, anglicky Pacific Yew), z jehož kůry se získává paclitaxel, komerčně známý jako taxol. Jde o velmi zajímavý složitý diterpen ze skupiny taxanů, které se s úspěchem používají v onkologii jako cytostatika. Intenzivní poptávka po paclitaxelu postupně vedla k ohrožení populací tisu západoamerického, navlas stejně, jako poptávka po dřevu na lučiště zdecimovala evropské tisy červené. Díky promyšlenému pěstování tisů na plantážích všechno nakonec dobře dopadlo, i tak je ale produkce paclitaxelu stále poměrně obtížná.

Proč je po něm taková sháňka? Paclitaxel a velmi podobný docetaxel (prodávaný jako Taxotere) z tisu červeného jsou takzvané vřeténkové jedy, které „zmrazí" proces tvorby mikrotubulů dělícího vřeténka a znehybní tak mitotické dělení buněk. Svým účinkem se liší od „barvínkových" alkaloidů rostlin z čeledi toješťovitých (Apocynaceae) typu vinblastin či vinkristin, které potlačují depolymerizaci vřeténkových mikrotubulů a také od slavného alkaloidu kolchicinu z ocúnu jesenního, který zase naopak potlačuje polymerizaci mikrotubulů. Paclitaxel se využívá především v chemoterapii pacientů s rakovinou plic, vaječníků a prsu, pak také u různých nádorů hlavy a krku a u rozvinuté formy Kaposiho sarkomu. Léčba paclitaxelem není samozřejmě nic moc příjemného, doprovázejí jí bohužel četné lehké i závažnější vedlejší účinky, přesto je ale významnou zbraní proti mnohým nádorům.

Taxol je velmi žádaný, drahý a špatně dostupný, tak se vědci již delší dobu snaží přimět bakterie, aby ho vyráběly rychleji a laciněji. Terapeutická dávka taxolu, který se podává jednorázově, přijde na zhruba 10 000 dolarů. Zároveň se na takovou dávku spotřebují dva až čtyři celé tisy západoamerické, což je pochopitelně problém. Biochemici sice objevili způsob, jak taxol kompletně nasyntetizovat v laboratoři, jejich řešení ale zahrnuje 35 až 50 často poměrně komplikovaných kroků s mizivou výtěžností, takže se to ekonomicky rozhodně nevyplatí. Příprava umělého taxolu také jde úplně jinou cestou než jakou představuje biosyntéza taxolu v živých tisech, takže i meziprodukty jeho laboratorní výroby jsou podle všeho medicíně k ničemu.

Ve snaze o elegantní řešení nedávno badatelé amerických univerzit MIT a Tufts, vedení Gregorym Stephanopoulosem ohlásili v časopise Science genetickou modifikaci stálic laboratorního nebe, bakterií E. coli, které jsou schopné produkovat 1000 krát více taxadienu, z něhož se pak relativně snadno udělá taxol, než stávající geneticky upravené kmeny bakterií. Ani tisy nedělají taxol úplně jednoduše. Metabolická dráha, která k němu vede, zahrnuje minimálně 17 kroků a dodnes ji tak úplně nerozumíme. Stephanopoulosův tým se zaměřil na dva meziprodukty biosyntézy taxolu - taxadien a taxadien-5-alfa-ol. Oblíbený laboratorní mazlík E. coli sice neumí syntetizovat ani tyto meziprodukty, ale shodou okolností bez problémů vyrábí isopentenyl pyrofosfát, známý jako IPP, který je v metabolismu tisů pouhé dva metabolické kroky od taxadienu. Pro genetické inženýry to byla výtečná příležitost k rafinovanému zákroku do genomu E. coli, který by ji přesvědčil k výrobě taxadienu.

Badatelé nejprve analyzovali metabolickou dráhu E. coli vedoucí k IPP a zjistili, že z čtyři z jejích osmi biochemických přeměn celou syntézu IPP významně zdržují, protože se při nich vytváří jen velmi omezené množství meziproduktů. Proto nejprve upravili genom E. coli tak, aby vytvářel větší množství oněch čtyř klíčových enzymů. Takto modifikované E. coli vyrábějí potřebný IPP mnohem rychleji. Do nich pak Stephanopoulos a spol. vkládali rozličné verze dvou upravených genů pro enzymy, které v tisech řídí dva kroky přeměny IPP na taxadien. V této fázi vědci nadšeně experimentovali a snažili se najít optimální dvojici variant obou zmíněných genů, která by zajistila nejlepší produkci taxadienu. Nakonec se jim podařilo vyřešit i další kritický krok biosyntézy taxolu, kterým je přeměna taxadienu na taxadien-5-alfa-ol. Je to vůbec poprvé, kdy bakterie dokázala vyrobit nějaký taxadien-5-alfa-ol.

Příběh výroby taxolu bakteriemi má stále ještě otevřený konec. Mezi taxadienem a taxolem je ještě 15 až 20 metabolických reakcí a jejich zvládnutí v bakteriích asi nebude úplně snadné. Přesto je však za Stephanopoulosem nesporně veliký kus práce. Badatelé jsou optimističtí a doufají v brzkou výrobu výrazně levnějšího a dostupnějšího taxolu. Jejich bakterie produkující záplavu taxadienu navíc mohou úspěšně využít i jiné týmy molekulárních inženýrů a upravit je například pro výrobu významných surovin pro kosmetický průmysl. Tak jako taxany léčí, tak zase jiné podobné diterpeny příjemně voní a chutnají. V MIT si už nový šikovný kmen E. coli patentovali a jsou připraveni zakládat nové společnosti nebo případně svoji biotechnologii licencovat.

Autor: RNDr. Stanislav Mihulka Ph.D, PřF JU, České Budějovice